Motivasi kerja guru merupakan faktor penting dalam mencapai tujuan pendidikan. Peningkatan motivasi kerja guru dapat dilakukan melalui supervisi kepala madrasah yang efektif, kultur organisasi yang positif, dan peningkatan kepuasan kerja. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui (1) pengaruh secara langsung supervisi kepala madrasah terhadap motivasi kerja guru, (2) pengaruh secara langsung kultur organisasi terhadap motivasi kerja guru, (3) pengaruh secara tidak langsung supervisi kepala madrasah terhadap motivasi kerja guru melalui kepuasan kerja, (4) pengaruh secara tidak langsung kultur organisasi terhadap motivasi kerja guru melalui kepuasan kerja. Metode Penelitian menggunakan pendekatan kuantitatif. Pengumpulan data dilakukan menggunakan kuesioner.Populasi sebanyak 188 guru madrasah swasta Kabupaten Berau. Teknik sampling penelitian ini menggunakan Stratified Random Sampling dengan jumlah sampel sebanyak 128 responden. Penelitian ini menggunakan analisis jalur dengan bantuan Program SPSS dan sobel test. Hasil penelitian menunjukkan bahwa : (1) Terdapat pengaruh secara langsung supervisi kepala madrasah terhadap motivasi kerja guru sebesar 0,378, (2) Tidak terdapat pengaruh secara langsung kultur organisasi terhadap motivasi kerja gurusebesar 0,099, (3) Terdapat pengaruh secara tidak langsung supervisi kepala madrasah terhadap motivasi kerja guru melalui kepuasan kerja sebesar 0,157, dan (4) Terdapat pengaruh secara tidak langsung kultur organisasi terhadap motivasi kerja guru melalui kepuasan kerja sebesar 0,041. Secara keseluruhan dapat disimpulkan bahwa kepuasan kerja menjadi mediator yang menghubungkan pengaruh supervisi kepala madrasah dan kultur organisasi terhadap motivasi kerja guru. Tanpa adanya kepuasan kerja yang tinggi, pengaruh supervisi kepala madrasah dan kultur organisasi terhadap motivasi kerja guru akan menjadi lemah atau bahkan tidak signifikan. Hasil penelitian ini dapat menjadi acuan madrasah di Kabupaten Berau dalam peningkatan motivasi kerja guru, yaitu dengan meningkatkan kegiatan supervisi, kultur organisasi yang positif dan dan memperhatikan tercapainya kepuasan kerja guru.