Gel Hand sanitizer ialah suatu antiseptik dalam bentuk sediaan gel yang dapat membantu membersihkan tangan ketika tidak tersedia air dan sabun. Namun, tidak semua hand sanitizer terdapat aktifitas dalam menghambat dan membunuh bakteri berbahaya. Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus merupakan dua bakteri dari gram negatif dan positif yang sering menyebabkan infeksi pada manusia dan masuk ke tubuh melalui hidung, makanan dan minuman. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan aktivitas antibakteri minyak atsiri kulit lemon menggunakan metode difusi sumuran terhadap Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus dan mendapatkan sediaan gel terbaik dengan menggunakan uji stabilitas sifat fisik. Formula basis dan sediaan gel diuji stabilitas sifat fisik menggunakan metode freeze-thaw cycling test selama 6 siklus meliputi organoleptik, homogenitas, pH, daya sebar, daya lekat, dan viskositas. Hasil penelitian menunjukkan formulasi sediaan gel terbaik dengan Karbopol 0,75% serta minyak atsiri kulit lemon dengan konsentrasi 10% memiliki aktivitas terbaik terhadap Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus.