Nanopartikel perak (AgNPs) merupakan bagian dari pengembangan nanoteknologi yang berkembang pesat saat ini yang memiliki sifat antimikroba, stabil dan mempunyai sifat konduktivitas yang baik. Sintesis nanopartikel perak lebih mudah dicapai melalui metode biologi dengan menggunakan ekstrak tanaman karena bersifat ramah lingkungan, sederhana, dan hemat biaya. Salah satu jenis tanaman yang dapat digunakan adalah bawang tiwai (Eleutherine palmifolia L. Merr). Bawang tiwai merupakan tanaman endemik Kalimantan yang kaya akan kandungan senyawa metabolit yang digunakan sebagai alternatif dalam pengembangan obat tradisional. Ekstrak tanaman bawang tiwai dapat diperoleh melalui teknik kultur jaringan tanaman yaitu metode kultur kalus. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh aktivitas antibakteri, mengetahui konsentrasi terbaik pada aktivitas antibakteri, dan mengetahui perbandingan efektivitas antibakteri dari ekstrak kalus dan nanopartikel perak kalus bawang tiwai terhadap bakteri B. subtilis dan E. coli. Penelitian ini menggunakan 6 konsentrasi yaitu ekstrak kalus bawang tiwai 3%, 6%, 9%, dan nanopartikel perak kalus bawang tiwai 3%, 6%, 9% dengan kontrol positif (kloramfenikol) dan kontrol negatif (DMSO 10%). Ekstraksi kalus bawang tiwai dilakukan dengan metode maserasi menggunakan alkohol 95%. Biosintesis nanopartikel perak kalus bawang tiwai menggunakan AgNO3 dengan konsentrasi 1 mM. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram kertas (Kirby-Bauer Diffusion). Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri dari ekstrak kalus dan nanopartikel perak kalus bawang tiwai memiliki pengaruh secara signifikan dengan terbentuk zona bening. Konsentrasi terbaik ditunjukkan pada nanopartikel perak kalus bawang tiwai 9% baik terhadap bakteri E. coli dan B. subtilis dengan rata-rata diameter zona bening yaitu sebesar 10,93 ± 1,19 mm dan 14,28 ± 1,21 mm. Jadi dapat disimpulkan bahwa nanopartikel perak kalus bawang tiwai lebih efektif sebagai antibakteri daripada ekstrak kalus bawang tiwai dengan kategori kuat pada bakteri B. subtilis dan bakteri E coli.