Sungai Sesayap dimanfaatkan dalam berbagai aspek kehidupan masyarakat. Sayangnya, sepanjang bentangan Sungai Sesayap khususnya di Tana Tidung banyak dijadikan sebagai kawasan pembuangan limbah sehingga mencemari air. Salah satu pencemarnya adalah fecal coliform. Oleh karena itu, dilakukan penelitian untuk mengetahui konsentrasi fecal coliform di wilayah Sungai Sesayap dan faktor yang mempengaruhinya serta menganalisis perbedaan konsentrasi fecal coliform pada setiap titik Sungai Sesayap. Studi ini menggunakan metode observasional dengan desain cross sectional. Penelitian dilakukan dengan mengambil sampel air Sungai Sesayap untuk diukur konsentrasi fecal coliformnya. Populasi pada penelitian ini sebanyak 485 orang dan diperoleh sampel sebanyak 87 responden dengan teknik purposive sampling. Setelah itu dilakukan observasi dan wawancara dengan instrumen kuesioner kepada responden untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi konsentrasi fecal coliform. Data dianalisis dengan uji ANOVA jika data homogen dan berdistribusi normal. Jika asumsi tidak terpenuhi, digunakan uji Kruskall Wallis sebagai alternatifnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat perbedaan konsentrasi fecal coliform pada tiga titik Sungai Sesayap (p value < 0,05). Adapun konsentrasi fecal coliform pada masing-masing titik sungai, yaitu cluster 1 1100 MPN/100 mL, cluster 2 1800 MPN/100 mL, dan cluster 3 1600 MPN/100 mL sehingga melebihi standar baku mutu pada PP No 22 Tahun 2021. Faktor sanitasi permukiman, meliputi pembuangan limbah, pembuangan kotoran (jamban), dan pembuangan sampah secara langsung ke sungai menjadi penyebab tingginya konsentrasi fecal coliform. Selain itu, faktor lainnya adalah beralih fungsinya lahan hutan menjadi permukiman dan limbah dari hewan ternak yang tidak diolah. Oleh karena itu, diperlukan intervensi lebih lanjut untuk meningkatkan kesadaran masyarakat terkait pengelolaan limbah.