Kanker payudara merupakan jenis kanker dengan peringkat satu sebagai jumlah kanker terbanyak dan penyumbang kematian tertinggi di Indonesia. Salah satu senyawa yang memiliki beragam aktivitas biologis termasuk antikanker adalah senyawa kalkon. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik dari senyawa 2’,2-dihidroksi5’-klorokalkon yang diprediksi dengan penambatan molekul. Senyawa 2’,2-dihidroksi5’-klorokalkon disintesis menggunakan metode Claisen-Schmidt dalam suasana basa dengan bahan dasar 2-hidroksi-5-kloroasetofenon dan 2-hidroksibenzaldehid selama 72 jam yang dikarakterisasi dengan instrument FTIR dan 1H-NMR. Studi in silico dilakukan antara senyawa kalkon dengan protein dengan kode PDB ID 3NXO menggunakan AutoDock Vina. Selanjutnya, dilakukan uji sitotoksik terhadap sel kanker payudara MCF-7 menggunakan metode MTT. Berdasarkan hasil karakterisasi menggunakan spektroskopi menunjukkan senyawa 2’,2-dihidroksi-5’-klorokalkon berhasil disintesis. Dari hasil docking menunjukkan senyawa 2’,2-dihidroksi-5’-klorokalkon berinteraksi dengan beberapa situs aktif pada enzim dihidrofolat reduktase. Hasil uji sitotoksik antara sel kanker MCF-7 dengan senyawa 2’,2-dihidroksi-5’-klorokalkon diperoleh nilai IC50 sebesar 5,88 µg/mL. Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa senyawa 2’,2-dihidroksi-5’-klorokalkon telah berhasil disintesis dan memiliki potensi inhibitor terhadap sel kanker payudara MCF-7.