Resistensi antibiotik menjadi isu kesehatan global yang menyebabkan peningkatan angka kematian yang tinggi dalam beberapa tahun terakhir. Pengembangan antibiotik baru yang lebih efektif diperlukan untuk mengatasi masalah ini. Senyawa pirazolina dipilih karena struktur cincin lima heterosikliknya yang telah terbukti memiliki berbagai aktivitas biologis, termasuk aktivitas antibakteri. Penelitian ini bertujuan untuk mensintesis senyawa 3-(2-hidroksi-5-klorofenil)-5-(4-metoksifenil) pirazolina disintesis dari bahan dasar 2-hidroksi-5-kloro-4-metoksikalkon dan hidrazin dengan katalis asam asetat glasial menggunakan metode refluks pada suhu 80°C selama 8-10 jam. Karakterisasi senyawa dilakukan melalui spektroskopi inframerah dan 1H-NMR. Hasil penelitian menunjukkan senyawa turunan pirazolina berhasil disintesis dengan rendemen reaksi 12,65%. Pengujian aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar sumuran menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki aktivitas terhadap bakteri gram positif (Staphylococcus aureus) dan bakteri gram negatif (Escherichia coli) dengan zona hambat berkisar antara 6,3 – 11,2 mm. Simulasi penambatan molekul juga menunjukkan potensi senyawa pirazolina dalam berinteraksi dengan enzim DNA Gyrase, yang relevan dalam pengembangan antibiotik.