Mitragyna speciosa atau yang lebih dikenal dengan Kratom sering dimanfaatkan oleh masyarakat Kalimantan sebagai obat tradisional. Kulit batang M. speciosa biasa digunakan sebagai bahan membuat bedak, oleh karena itu tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan isolasi dan uji toksisitas serta aktivitas antioksidan dari senyawa murni hasil isolasi. Pada ekstrak kulit batang M. speciosa dilakukan isolasi menggunakan kromatografi kolom tekan (KKT), uji toksisitas menggunakan metode brine shrimp lethality test (BSLT) dan uji aktivitas antioksidan menggunakan metode peredaman radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH). Hasil fraksinasi dari fraksi n-heksana dengan KKT diperoleh sebanyak 7 fraksi (H.1 - H.7). Fraksi H.2 dimurnikan lebih lanjut dengan KKT menghasilkan 12 fraksi (H.2.1 - H.2.12). Fraksi H.2.3; H.2.4 dan H.2.5 dilakukan rekristalisasi hingga diperoleh isolat murni berupa padatan berwarna putih sebanyak 78,5 mg. Berdasarkan hasil identifikasi dengan uji KLT terhadap senyawa pembanding, uji fitokimia secara KLT dengan pereaksi vanilin-asam sulfat dan LiebermanBurchard, serta analisa spektroskopi UV dan FT-IR, isolat murni yang diperoleh diduga merupakan senyawa β-sitosterol. Isolat ini memiliki tingkat toksisitas yang kuat terhadap Artemia salina dengan nilai LC50 sebesar 98,18 ppm dan memiliki aktivitas antioksidan kategori sedang dengan nilai IC50 sebesar 110,45 ppm.