Penyakit layu Fusarium menjadi masalah utama yang dapat merugikan bagi petani cabai. Penyakit layu fusarium disebabkan oleh jamur patogen Fusarium sp. Teknik pengendalian penyakit layu fusarium yang paling banyak dilakukan oleh petani cabai adalah menggunakan pestisida kimia, yang mana dapat menimbulkan dampak negatif bagi tanaman dan lingkungan. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu pengendalian alternatif yaitu dengan memanfaatkan pestisida nabati yang ramah terhadap lingkungan. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstrak daun mengkudu dan daun sirih dalam menghambat pertumbuhan Fusarium sp. dan untuk mengetahui konsentrasi terbaik dalam menghambat jamur Fusarium sp. penyebab penyakit layu fusarium pada tanaman cabai (Capsicum frutescens L.) secara in vitro. Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Mulawarman berlangsung pada bulan Juni sampai September 2023. Percobaan dilakukan dengan metode eksperimental yang disusun dalam Rancangan Acak Lengkap Non Faktorial dengan 10 taraf perlakuan dan diulang sebanyak 3 kali. Faktor tunggal dalam penelitian ini adalah konsentrasi kombinasi ekstrak daun mengkudu dan daun sirih. Data yang diperoleh dianalisis menggunakan sidik ragam (ANOVA) dan dilakukan uji lanjut BNT (Beda Nyata Terkecil) pada taraf α5%. Penelitian ini menunjukkan pemberian kombinasi ekstrak daun mengkudu dan daun sirih telah memberikan aktivitas penghambatan pertumbuhan koloni jamur Fusarium sp. Pemberian perlakuan ekstrak daun mengkudu 5% dan sirih 5% memiliki efektivitas terbaik dalam menghambat pertumbuhan koloni jamur ditunjukkan pada data daya hambat sebesar 10,37% sampai 45,12%. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas antifungi ekstrak daun mengkudu dan sirih mampu menghambat pertumbuhan miselium jamur Fusarium sp.