Tempoyak adalah salah satu makanan tradisional hasil fermentasi spontan pada buah durian lai dengan bantuan bakteri yang memiliki umur simpan pendek. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan optimasi penggunaan garam, gula dan waktu fermentasi terhadap kualitas berdasarkan total bateri asam laktat , total bakteri dan angka kapang khamir terhadap tempoyak durian lai. Apakah terdapat pengaruh signifikan dari optimasi penggunaan garam, gula dan waktu fermentasi terhadap bakteri pada tempoyak durian lai. Metode penelitian ini menggunakan RSM (Response Surface Methodology) Box Bhenken Desain (BBD) dengan 3 faktor yaitu konsentrasi garam, gula dan waktu fermentasi. Penelitian ini menggunakan 15 perlakuan dengan 3 kontrol atau 3 titik tengah berdasarkan try and eror. Hasil penilitian ini menunjukkan bahwa penambahan garam, gula dan waktu fermentasi yang berbeda mempengaruh bakteri asam laktat, total bakteri dan angka kapang khamir. Nilai analisis bakteri asam laktat 9,4 CFU/mL, total bakteri 6,9 CFU/ mL dan angka kapang khamir 3,2 CFU/mL. Berdasarkan hasil penelitian maka dapat disimpulkan hasil optimasi formulasi didapatkan nilai konsentrasi garam 3 gram, konsentrasi gula 1 gram dan waktu fermentasi 2 hari, dengan hasil prediksi bakteri asam laktat 9,6 CFU/mL, total bakteri 7,2 CFU/ mL dan angka kapang
khamir 3,4 CFU/ mL. Berdasarkan hasil validasi formula maka didapatkan hasil bakteri asam laktat 9,9 CFU/ mL, total bakteri 7,8 CFU/ mL dan angka kapang khamir 3,7 CFU/ mL.