Indonesia memiliki keanekaragaman hayati yang memiki potensi besar dalam pengembangan obat-obatan yang berasal dari tanaman, salah satunya sirih hitam. Sirih hitam merupakan tanaman endemik Indonesia yang berpotensi sebagai antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antimikroba ekstrak etil asetat daun sirih hitam terhadap mikroba patogen Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, dan Candida albicans. Sirih hitam dimaserasi bertingkat dengan menggunakan pelarut n-heksan, etanol, dan pelarut etil asetat. Tetapi yang dilanjutkan kepengujian hanya dari pelarut etil asetat. Metode penelitian yang digunakan adalah difusi sumuran. Data dikumpulkan dari diameter zona hambat (mm). Konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 10%, 20% dan 30%. Hasil penelitian yang diperoleh adalah terdapat aktivitas ekstrak etil asetat daun sirih hitam ditandai dengan zona hambat yang terbentuk yaitu pada bakteri Streptococcus mutans pada masing-masing konsentrasi 10%, 20%, dan 30% yaitu memberikan hambatan sebesar 10,359 mm, 10,173 mm, dan 14,268 mm. Pada bakteri Streptococcus sanguinis dengan konsentrasi 10%, 20%, dan 30% masingmasing memberikan hambatan sebesar 8,504 mm, 9,677 mm, dan 13,575 mm. Pada jamur Candida albicans dengan konsentrasi ekstrak etil asetat sebesar 10%, 20% dan 30% masing-masing memberikan hambatan sebesar 4,409 mm, 8,670 mm, dan 11,018 mm. Hasil interpretasi yang diperoleh dari analisis LC-MS/MS yaitu ada 17 senyawa dugaan dari ekstrak etil asetat daun sirih hitam yang terdiri dari beberapa golongan senyawa yakni flavonoid, alkaloid, fenolik, asam amino, dan asam lemak.