Latar Belakang: Enterococcus faecalis menyebabkan berbagai infeksi, termasuk endocarditis, infeksi saluran kemih, serta infeksi luka. Enterococcus faecalis umumnya terdeteksi pada infeksi endodontik persisten tanpa gejala. Prevalensinya berkisar antara 24% hingga 77%. Daun sirih hitam (Piper betle L. var nigra) merupakan tanaman herbal yang mengandung minyak atsiri. Minyak atsiri diketahui memiliki sifat antibakteri, salah satunya yaitu terhadap bakteri Enterococcus faecalis. Tujuan: Untuk mengetahui aktivitas antibakteri minyak atsiri daun sirih hitam (Piper betle L. var nigra) terhadap pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis. Metode: penelitian eksperimental dengan 12 kelompok uji yaitu perlakuan dengan konsentrasi 4%, 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%, 0,062%, 0,031%, 0,015%, 0,007%, 0,003%, 0,001%, kelompok kontrol positif (eugenol) dan kontrol negatif (DMSO 10%) dengan metode mikrodilusi untuk melihat kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM) menggunakan metode streak plate dari hasil uji aktivitas antibakteri mikrodilusi sebelumnya dengan nutrient agar (NA). Hasil: Hasil penelitian ini menunjukan adanya aktivitas antibakteri ditandai dengan terdapatnya sumuran yang tidak berubah warna atau jernih pada beberapa konsentrasi dan pada NA terdapat bakteri yang tidak tumbuh. Kesimpulan: Minyak atsiri daun sirih hitam (Piper betle L. var nigra) memiliki kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri Enterococcus faecalis.