Pengetahuan Teknologi Pedagogis dan Konten (TPACK) sangat penting untuk pengajaran yang terintegrasi dengan teknologi. Namun, kemampuan TPACK mahasiswa calon guru sangat jarang diselidiki. Maka dari itu, penelitian ini bertujuan untuk menganalisis TPACK kemampuan mahasiswa calon guru fisika berbasis gender selama mata kuliah Microteaching. Mata kuliah ini diikuti oleh 30 mahasiswa calon guru fisika, yang terdiri dari 15 perempuan dan 15 laki-laki, pada tahun akhir program pendidikan guru. Penelitian ini menggunakan metode kuantitatif dengan observasi video microteaching sebagai teknik pengumpulan data. Untuk menganalisis data yang diterima dari observasi video, maka digunakan sebuah lembar observasi. Lembar observasi ini terdiri dari 6 aspek TPACK yaitu Content Knowledge, Pedagogical Knowledge, Technological Knowledge, Pedagogical Content Knowledge, Technological Content Knowledge dan Technological Pedagogical Knowledge serta memiliki 4 indikator untuk setiap aspek. Indikator yang ada merupakan contoh dari tiap aspek yang dapat diamati pada video microteaching. Berdasarkan hasil penelitian, sebagian besar mahasiswa calon guru guru memiliki kemampuan TPACK pada kategori Sedang sampai Tinggi, namun mahasiswa calon guru laki-laki memiliki keterampilan TPACK yang lebih kuat ketimbang mahasiswa calon guru perempuan terutama pada aspek Pedagogical Knowledge. Oleh karena itu, mahasiswa calon guru harus diberikan kesempatan untuk meningkatkan kemampuan TPACK mereka sebagai bagian dari program pendidikan guru mereka agar dapat berhasil mengintegrasikan teknologi ke dalam pengajaran mereka.