Tumbuhan Diospyros borneensis Hiern merupakan tumbuhan endemik Kalimantan yang masih belum diketahui kandungan metabolit sekundernya. Hal ini menjadi potensi besar dalam pengembangannya sebagai tumbuhan berkhasiat obat. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metabolit sekunder yang terkandung pada ekstrak, mendapatkan isolat hasil isolasi dan menganalisis struktur kimia senyawa isolat hasil isolasi dari ekstrak n-heksan kulit batang Diospyros borneensis Hiern. Penelitian diawali dengan dilakukannya maserasi secara bertingkat menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat dan metanol hingga hasil saringan yang diperoleh berwarna bening pada tiap ekstraknya. Masingmasing ekstrak diidentifikasi dengan uji skrining fitokimia menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Proses selanjutnya, untuk menentukan eluen dengan pemisahan dan isolasi terbaik dilakukan dengan menggunakan berbagai teknik kromatografi yaitu Kromatografi Cair Vakum (KCV), Kromatografi Kolom Konvensional (KKK), KLT, rekristalisasi dan uji kemurnian hasilnya dilakukan menggunakan KLT Dua Dimensi. Isolat yang telah diperoleh kemudian dilakukan karakterisasi struktur kimia dengan berbagai data spektroskopi. Hasil uji skrining fitokimia pada tumbuhan Diospyros borneensis Hiern terdeteksi mengandung senyawa alkaloid, fenol, flavonoid dan terpenoid. Struktur senyawa isolat hasil isolasi yaitu senyawa lupeol golongan triterpenoid diperoleh dari ekstrak n-heksan kulit batang Diospyros borneensis Hiern.