ABSTRAK
Insulin glargine adalah analog insulin manusia yang dibuat dengan teknologi DNA rekombinan, dengan melibatkan modifikasi susunan sekuen gen insulin manusia. Beberapa kendala pada pengekspresian protein insulin glargine yaitu, pengekspresian menggunakan sel inang E. coli dan P. Pastoris membentuk inclusion body.
Teknik fusi protein menggunakan mitra protein yang memiliki kelarutan yang tinggi menjadi solusi yang dapat mengatasi inclusion body. Salah satu protein yang dapat dijadikan mitra fusi adalah enzim DPEase yang disandikan oleh gen dpe yang diisolasi dari bakteri Agrobacterium tumefaciens berukuran 870 bp pada kromosom linear. Selain itu DPEase memiliki 290 asam amino dengan persentase ±14% asam amino yang bermuatan negatif tersebar diseluruh permukaan enzim, sehingga memungkinkan hasil dari eskpresi enzim DPEase ini memiliki solubilitas protein yang tinggi dalam keadaan soluble. Penelitian ini bertujuan untuk membuat plasmid baru pCBRG dpe-ins melalui rekonstruksi vektor plasmid pET-21b dengan insert fusi gen dpe-ins dan meningkatkan serta mengoptimasi solubilitas protein hasil ekspresi dari gen penyandi prekursor insulin glargine dalam bentuk fusi protein dpe-ins.
Tahapan penelitian dimulai dari studi bioinformatika, lalu amplifikasi gen dpe dan gen ins, dilanjutkan dengan penggabungan gen fusi dpe-ins menggunakan teknik Combined Overlap Extension-PCR (COE-PCR). Kemudian ligasi ke dalam vektor pGEM®-T Easy. Koloni positif dikonfirmasi dengan teknik PCR, pemotongan plasmid dengan enzim restriksi. Gen fusi dpe-ins kemudian disubklon ke plasmid pET-21b dan ditransformasi ke bakteri E. coli BL21 (DE3) untuk proses ekspresi gen. Ekspresi gen dilakukan dengan induksi IPTG dan dianalisis dengan SDS-PAGE elektroforesis.
Rekonstruksi plasmid pCBRG dpe-ins telah berhasil dilakukan subkloning ke dalam sel inang E. coli BL21(DE3), ditunjukkan dengan hasil konfirmasi PCR pada plasmid pCBRG dpe-ins berukuran 1507 bp dan konfirmasi digest treatment menggunakan enzim restriksi spesifik Xho1 berukuran 6692 bp. Lokalisasi hasil ekspresi protein pCBRG dpe-ins telah berhasil meningkatkan solubilitas insulin glargine dalam bentuk terfusi dengan enzim DPEase, ditunjukkan dengan hasil distribusi protein pada fraksi supernatan berukuran 52 kDa dan tidak terdapat pada fraksi pellet yang menunjukkan protein fusi gen dpe-ins tereskpresi dalam keadaan larut air (soluble).