Banyaknya usaha jasa laundry memberi andil yang cukup besar terhadap pencemaran air khususnya di Kota Samarinda dan sekitarnya. Adanya usaha jasa laundry memiliki dampak negatif yaitu limbah yang dihasilkan oleh sisa dari proses laundry yang dapat menyebabkan pencemaran air apabila tidak dikelola dan diolah dengan baik. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengolah limbah cair laundry dengan metode biofilter untuk mengetahui pengaruh media dan waktu tinggal pada biofilter aerob dalam pengolahan limbah cair laundry. Penelitian ini menggunakan sistem batch. Proses seeding dan aklimatisasi pada penelitian ini selama 14 hari, selama 14 hari di ukur parameter BOD, COD, TSS, Total Fosfat dan pH, dimaksudkan untuk mengetahui pertumbuhan mikroorganisme. Waktu tinggal yang digunakan adalah 4 jam, 6 jam, 8 jam, 10 jam dan 12 jam. Jenis media yang digunakan adalah sarang tawon dan bioball. Dari hasil analisa dapat disimpulkan bahwa jenis media yang paling efektif pada biofilter dalam menurunkan parameter BOD, COD, TSS, Total Fosfat dan pH pada limbah cair laundry adalah media bioball dan waktu tinggal yang paling efektif yaitu waktu tinggal selama 12 jam, dimana semakin lama waktu tinggal, maka semakin besar zat organik yang didegradasi oleh mikroba semakin besar. Berikut efisiensi penurunan konsentrasi pada waktu pengamatan 12 jam: BOD sebesar 88,72%, COD sebesar 86%, TSS sebesar 78,95%, Total Fosfat sebesar 69,43% dan pH sebesar 16,30%. Kata Kunci : Limbah Laundry, Biofilter, Sarang tawon, Bioball.