Mitragyna speciosa Korth. berasal dari keluarga Rubiaceae banyak tumbuh di negara-negara Asia Tenggara. Di Indonesia khususnya di daerah Kalimantan Timur dikenal sebagai "Kadamba". Tumbuhan ini dalam lembar ilmu etnofarmaka mempunyai kandungan senyawa mayoritas golongan alkaloid yaitu secara umum berfungsi sebagai Analgesik, antitusif, antidiarrheal, adrenergik, antimalarial, antibakteri dan antinosiseptif. Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui teknik isolasi dan uji aktivitas antibakteri senyawa golongan alkaloid pada daun Kadamba. Pada penelitian ini dilakukan ekstraksi dengan pelarut metanol kemudian metode pemisahan senyawa alkaloid menggunakan Kromatografi cair vakum (KCV) dan Kromatografi Kolom (KK) dengan eluen gradien kemudian identifikasi tiap tahap pemisahan menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) lalu diamati dibawah sinar UV 254 nm dan 366 nm setelah itu disemprot menggunakan pereaksi Dragendorff lalu pemurnian dan uji kemurniaan dengan metode Kromatografi Lapis Tipis preparatif (KLTP) dan KLT 2 Dimensi kemudian dianalisis pada spektrofotometri UV-Vis dengan rentang 200-800 serta pengujian aktivitas antibakteri mettode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Bioautografi. Hasil penelitian diperoleh satu isolat yaitu isolat Fraksi B6-b teridentifikasi golongan alkaloid berdasarkan hasil Identifikasi KLT dan KLT 2 Dimensi dengan penyemprotan pereaksi Dragendroff serta Panjang gelombang maksimum pada analisis spektrofotometri UV-Vis isolat tersebut memiliki 288 nm yang menunjukkan bahwa isolat tersebut adalah golongan alkaloid. Pengujian aktivitas antibakteri tidak menunjukkan adanya zona hambat pada metode KLT Bioautografi dapat disimpulkan bahwa isolat tersebut salah satu golongan alkaloid yang tidak memiliki aktivitas antibakteri pada bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus