Setiap tanaman mengandung beberapa fungi endofit yang dapat menghasilkan metabolit sekunder, salah satunya yaitu tanaman Akar Kuning. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui teknik mengisolasi senyawa metabolit dari isolat fungi endofit Akar Kuning (Arcangelisia flava L. Merr.), karakterisasi senyawa menggunakan spektrofotometer Ultraviolet Visible serta hasil pengujian aktivitas antibakteri dari isolat senyawa. Isolasi senyawa menggunakan beberapa metode yaitu kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi kolom konvensional (KKK), kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) dan diuji kemurnian menggunakan metode kromatografi lapis tipis dua dimensi hingga diperoleh isolat senyawa yang murni. Isolat senyawa diuji antibakteri menggunakan metode KLT Bioautografi dan dikarakterisasi dengan spektrofotometer UV-Vis. Hasil penelitian diperoleh isolat yang positif steroid pada Rf 0,47 saat disemprot menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard dengan menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (1:3). Hasil uji antibakteri menggunakan KLT Bioautografi diperoleh isolat senyawa tidak terdeteksi memiliki aktivitas antibakteri. Hasil karakterisasi menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, diperoleh panjang gelombang maksimum 274 nm yang menghasilkan absorbansi sebesar 1,677 A.