Penggunaan antibiotik di Indonesia sangat tinggi dan menjadi permasalahan bagi tenaga kesehatan untuk melakukan pengawasan serta pemberian edukasi sebagai upaya pencegahan kesalahan dalam penggunaan antibiotik. Tingkat pengetahuan menjadi salah satu faktor penentu terhadap perkembangan tingkat resistensi antibiotik. Penelitian ini bertujuan untuk mengukur tingkat pengetahuan serta perilaku penggunaan antibiotik dan resistensinya pada mahasiswa di Universitas Mulawarman. Penelitian ini menggunakan metode cross-sectional dan menggunakan kuisioner. Hasil penelitian menunjukkan tingkat pengetahuan tentang antibiotik pada mahasiswa kesehatan, mayoritas berada pada tingkat cukup baik dengan persentase 41,4 %, sedangkan pada mahasiswa non-kesehatan, mayoritas berada pada tingkat baik dengan persentase 36,7 %. Tingkat perilaku mahasiswa kesehatan terhadap penggunaan antibiotik, mayoritas berada pada tingkat baik dengan persentase 46,8 %, sedangkan pada mahasiswa non-kesehatan, mayoritas berada pada tingkat cukup baik dengan persentase 49,2 %. Hasil uji korelasi dengan analisis spearman menunjukkan adanya hubungan yang kuat antara tingkat pengetahuan dan perilaku responden dengan nilai koefisien korelasi 0,885 pada mahasiswa kesehatan dan 0,892 pada mahasiswa non-kesehatan.