Eleutherol merupakan senyawa aktif yang terdapat didalam umbi bawang tiwai (Eleutherine americana(Aubl.) Merr) yang diketahui dapat menghambat pembentukan alpha-glukosidase dalam memproduksi hormon insulin. Pada penelitian ini dilakukan analisis senyawa eleutherol didalam plasma menggunakan KCKT. Tujuan penelitian ini adalah memperoleh kondisi optimal serta metode yang tervalidasi untuk analisis eleutherol dalam plasma secara in vitro menggunakan KCKT dengan detektor UV. Eleutherol di deproteinasi dalam plasma dengan perbadingan 1:4 kemudian di vortex selama 5 menit, lalu di sentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 3600 rpm. Analisis dilakukan secara isokratik dengan kolom C18 dengan fase gerak Buffer Fosfat : Metanol (20:80) pada laju alir 1,0 mL/menit. Sampel didteksi pada panjang gelombang 363 nm. Pada rentang konsentrasi 1-7 ppm diperoleh kurva kalibrasi yang linier dengan koefisien korelasi r sebesar 0,9995. Pada uji LOD dan LOQ diperoleh nilai LOD sebesar 0,001135 ppm dan LOQ sebesar 0,0034401 ppm. Akurasi dinyatakan dengan %Recovery sebesar 100,2899%. Presisi dinyatakan dengan koefisien variasi (KV) dengan nilai KV 0,0107%.
Kata Kunci: Eleutherol, Plasma, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT), Validasi metode.