Fungi endofit terdapat di dalam jaringan tumbuhan dan mampu menghasilkan senyawa bioaktif yang sama seperti inangnya. Tujuan dari penelitian ini adalah mengisolasi fungi endofit dari Akar Tapak Dara (Catharanthus roseus L.) yang menghasilkan senyawa alkaloid. Metode yang digunakan untuk isolasi fungi endofit adalah metode tanam langsung (Direct Seed Planting) pada media PDA (Potato Dextrose Agar) dan identifikasi senyawa alkaloid dilakukan menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan menggunakan pereaksi Dragendorff sedangkan karakterisasi senyawa dilakukan menggunakan Spektrofotometer Uv-vis (Ultraviolet-Visible). Hasil penelitian didapatkan 1 isolat fungi endofit akar Tapak Dara dengan kode fungi ATD B1 dengan teknik sterilisasi permukaan menggunakan etanol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit 5,25% selama 3 menit dan aquades steril 30 detik menghasilkan frekuensi pertumbuhan koloni sebesar 54,28%. Hasil identifikasi senyawa alkaloid diperoleh 2 isolat yaitu, subfraksi dari fungi ATD B1 isolat A-18 menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (1:1) dengan nilai Rf 0,5 dan isolat B-45 menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (2:3) dengan nilai Rf 0,7 dan hasil analisis senyawa alkaloid pada isolat A-18 menggunakan spektrofotometer UV-Vis diperoleh panjang gelombang 235 nm yang menghasilkan absorbansi 4,051.
Kata kunci: Fungi Endofit, Tapak Dara, Catharanthus roseus, Alkaloid.