Sebuah metode spektrofotometri yang sederhana, cepat, biaya murah serta akurat untuk penentuan antibiotik Chloramphenicol telah dikembangkan. Metode ini didasarkan pada reaksi diazotisasi sulfanilamid dengan Chloramphenicol sebagai pengkopling. Adapun hasil akhir penelitian ini adalah terbentuknya senyawa azo yang dengan panjang gelombang maksimum 400,941 nm. Senyawa ini stabil apabila direaksikan pada temperatur di bawah 10°C. Parameter analitik seperti pengaruh waktu kopling serta optimasi volume reagen untuk pembentukkan senyawa azo telah diteliti. Pada optimasi waktu kopling untuk pembentukkan senyawa diazo diperoleh absorbansi maksimum sebesar 0,051 dan diketahui waktu kopling optimum untuk pembentukkan senyawa azo adalah 8 menit. Sedangkan optimasi volume reagen sebagai sumber garam diazonium seperti Sulfanilamid, HCl dan NaNO2 masing-masing diperoleh absorbansimaksimum sebesar 0,236; 0,235 dan 0,028 dan diketahui volume optimum reagenmasing-masing adalah 3 mL, 3 mL dan 6 mL. Adapun koefisien korelasi (r) yangdiperoleh sebesar 0,9801, nilai Absorptivitas Molar sebesar 32,323 L/mol.cm dan Sensitivitas Sandell’s sebesar 0,010 x 103 µg.cm-2 /0,001 unit absorbansi.
Kata kunci: Chloramphenicol, Sulfanilamid, diazotasi, Spektrofotometri UV-Vis.